流式细胞术检测急性冠脉综合征患者血小板表面糖蛋白的变化(1)
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【摘要】 目的 探讨急性冠脉综合征患者及其服用阿司匹林前后血小板表面糖蛋白的变化及其意义。方法 采用流式细胞仪(FCM)测定急性冠脉综合征患者阿司匹林治疗前后的全血中血小板表面糖蛋白(CD62p /PAC1)的表达率，采用自身对照分析阿司匹林对血小板表面糖蛋白的影响。结果 急性冠脉综合征组治疗前的血小板表面糖蛋白PAC1、CD62p的表达率分别为(10.36±6.15)%和(10.72±7.12)%，较健康对照组明显升高(P<0.001)，经以阿司匹林为基础的抗血小板治疗后CD62p、PAC1的表达率下降至(4.32±2.08)%和(4.90±2.37)%，(P<0.001)，但仍高于健康对照组。结论 CD62p和PAC1是血小板活化的敏感和特异指标，且相关性良好，阿司匹林能够抑制血小板表面糖蛋白的表达，从而抑制血小板活化，抑制血栓形成。
【关键词】
急性冠脉综合征；血小板表面糖蛋白；流式细胞术
作者单位：100083北京市第六医院心内科
随着人群的老龄化，动脉粥样硬化所带来的血栓栓塞性疾病越来越受到重视，特别心脑血管疾病，其致残率和致死率高，近年来阿司匹林的使用可以使心脑血管疾病高危患者降低25%的心脑血管病事件如死亡，心肌梗死，卒中；降低48%的血管搭桥及动脉栓塞事件；减少肺栓塞事件67%[1]。但是有大规模的临床观察及实验研究[24]均发现有阿司匹林抵抗现象。临床长期随访时上发现应用在使用抗血小板药物后，仍然有一部分心脑血管疾病患者血栓栓塞事件，加大治疗剂量，不仅未能达到治疗及预防目的，而且不良反应增加，这种现象称为“阿司匹林抵抗”(Aspirin resistance AR)。所以对于危险程度高的冠心病患者需要强化抗血小板治疗，即联合多种抗血小板药物治疗，这种强化治疗很需要一种非常敏感而且可靠的血小板功能的检测方法作为参考。但是目前尚没有一个公认的血小板功能检测方法，大多都是反映血小板聚集的实验，而流式细胞术是通过检测血小板活化时血小板表面的糖蛋白的表达，从免疫、受体水平评估血小板功能。本研究就是利用流式细胞仪(FCM)测定不同危险程度的急性冠脉综合征(ACS)患者的血小板表面糖蛋白的表达水平对其进行分析及意义及FCM的可行性。
1 资料与方法
1.1 一般资料 本院自2010年4月至2010年9月连续入院的38例符合WHO诊断标准的初治的ACS患者(非ST抬高25例，不稳定性心绞痛13例)，男21例，女17例，平均年龄为71.6岁。所有患者均经心肌酶、心肌损伤标志物，心电图，急诊或择期冠脉造影证实。入院后每天于晨起餐后服用阿斯匹林100 mg，连续服用7~10 d，其他抗心肌缺血药物均按指南使用，治疗期间禁止使用其他明确的抗血小板药物，如：波立维，抵克利得，GPⅡb/Ⅲa受体拮抗剂。排除标准：明确ST段抬高型心肌梗死，合并有各种血液系统疾病，具体如下：血友病、白血病、再障、ITP等特别是有血小板功能异常者；近期有外伤、手术及出血史；合并有肝肾疾病、肿瘤、脾亢、脑出血者；血小板计数在100~450万之外者。健康对照组(Control)22 例为同期我院无明显心脑血管疾病的门诊体检者,男12例,女10 例,平均年龄68.5岁。
1.2 方法
1.2.1 主要仪器
FACSCalibar流式细胞仪为美国BD公司产品,Falcon 上样管。
1.2.2 主要试剂
①单克隆抗体: PAC1 FITC 为异硫氰酸荧光素标记的抗GP Ⅱb/Ⅲa (即纤维蛋白原受体, FibR) McAb,CD62P PE 为藻红蛋白标记的抗P2选择素的McAb ; CD61 PerCP 为Peridininchlorophyll protein 标记的血小板糖蛋白Ⅲa 的McAb(均购自美国BD 公司)。② 同型对照:异硫氰酸荧光素标记Mouse IgM、MousePE 为藻红蛋白标记的鼠IgG(均购自美国BD 公司)。
1.2.3 样本采集 病例组入院后服用阿司匹林前以及经治疗7~10 d病情稳定后分两次于晨起7时抽取肘前静脉血,不扎止血带,弃去前2 ml可能混有组织液的血液,将样本加入CTAD管中,轻轻混匀，避免剧烈的摇动而影响对血小板的检测。20 min内对血小板进行荧光标记、固定、检测。
1.2.4 标本制备 将试管标号区分对照管和实验管。对照管内加入RGDS、MouseγPE、CD61 PerCP 各10 μl;试验管加入PAC1 FITC、CD62P PE、CD61 PerCP 各10 μl,轻轻混匀,避光室温孵育20 min,立刻加入预冷2～8℃的1 %多聚甲醛0.5 ml并混匀,放置于2～8 ℃冰箱中30 min。以上步骤均在2 h内完成,以减少血小板体外活化。标本制备后进行上机检测。
1.2.5 上机检测 用CellQuest软件获取并分析样本，具体如下：a、FSC和SSC设对数放大阈值设在CD61PerCP上，b、在SSC和CD61PerCP点图上圈定所有的血小板群，包括与白细胞粘附的血小板。c、用同型对照抗体染色的标本调整FL1和FL2电压如：CD61PerCP/同型对照FITC/同型对照PE，d、活化血小板染色的标本调节补偿,CD61PerCP/PAC1 FITC/同型对照PE 调节FITC对PE的干扰。e、CD61PerCP/同型对照FITC/CD62PPE调节PE对FITC的干扰。
1.2.6 统计学方法 应用SPSS 11.5 统计软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，治疗前后血小板糖蛋白之间的比较采用自身配对t检验。
2 结果
38位入选的病例均圆满完成实验，住院期间无心源性死亡及其他心源性事件发生、无严重的出血事件。ACS组的PAC1及CD62P表达均高于Control组(P<0.001)。经以阿司匹林抗血小板治疗为主的综合治疗后的血小板表面糖蛋白水平明显较治疗前下降，但仍高于正常对照组(P<0.001)，见表1。
表1
各组治疗前后血小板表面CD62P、Pac1 的表达率(%) ......
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